【摘要】： 前言 地龍(earthworm)又稱蚯蚓，別名“地龍子”，系無脊椎動物，是生物進化過程中最先具有免疫記憶和識別的動物之一，廣泛分布于我國各地。具有清熱平肝、消炎止痛、活血化淤及主治高熱狂燥等功效，可治療20多種疾病，是我國寶貴的中藥材之一。臨床上地龍肽常被用于治療細菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病和腫瘤。近年來人們從地龍體內提取了多種具有生物活性的肽類，如纖維蛋白溶解酶、催產(chǎn)素相關肽、肌肉運動活性肽等。地龍肽是地龍體內小分子多肽的總稱，種類繁多，生物功能復雜多樣。具有免疫活性的地龍肽，因其具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用越來越引起人們的關注。例如地龍?zhí)崛∥颎-90和912對黑色素瘤和喉癌等腫瘤有明顯的抑制作用，912可增加胸腺、脾的重量以及細胞數(shù)目，消除放療引起的T細胞免疫功能的低下和輻射引起的體液免疫功能低下。粗分離的地龍?zhí)崛∥锟梢曰罨奘杉毎岣逳K、LAK細胞的活性，增強ADCC效應。但這些地龍?zhí)崛∥镏苽浜唵?，成分復雜，分子量大，藥效低，副作用大，不利于其藥理機制的研究。本試驗所用的地龍肽(lumbricus peptide，LP)是經(jīng)過清洗、破碎、抽提、離心、過濾、超濾及色譜等步驟從新鮮正蚓科(lumbricidea)愛勝屬赤子愛勝蚓(Eiscmia foctida)體內提取的小分子量多肽，純度較高，是由幾種8000～20000Dal的多肽組成。本實驗室已證實地龍肽在體外實驗中可明顯增強NK細胞活性，提高NK殺傷率，同IL-2有協(xié)同作用，拮抗環(huán)磷酰胺和地塞米松的免疫抑制作用。但是尚不清楚此地龍肽對于巨噬細胞等其它免疫細胞以及細胞因子分泌水平的影響，同時小鼠體外實驗條件不能代表小 鼠整個機體內環(huán)境，因此本實驗擬建立小鼠地龍肽給藥模型和免 疫抑制模型，在體外進一步探討地龍肽對小鼠NK細胞活性的影 響，同時還進一步研究地龍肽對巨噬細胞及脾細胞生物活性影響 的作用機制，為地龍肽將來能應用于臨床提供實驗理論依據(jù)。 實驗材料 1．藥品與試劑： 地龍肽：按本試驗室方法制備，共有7種多肽成分，分子量為 8000—－20000Dal，經(jīng)E花環(huán)形成實驗檢測具有提高E花環(huán)形 成能力，用時以蒸餾水配成不同的濃度；環(huán)磷酸胺（Cyclophospha－ mide，Cy，上海華聯(lián)制藥有公司，200mg／支h 10％FCS RPMI－ 1640（胎牛血清為華美生物制劑生產(chǎn)八0．5％BSA RPMI－1640 （牛血清白蛋白為北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心生物工程研究室產(chǎn)＊吩 嗓H甲酉硫酸鹽即PMS（Bioche而ka）；氧化型輔酶1即NAD（Bio－ tee八左旋乳酸（siglna）；碘硝基氯化四氮哩即INTk 入細菌脂 多糖（LPS人 GreSS試劑規(guī)TI’等。 2．實驗動物： C57BL／6純系小鼠，雌雄各半，體重 20。Zg，6edw，購于本 校實驗動物部。 s．腫瘤細胞系：小鼠紅白細胞白血病細胞（Ya－l）株，小鼠 成纖維瘤細胞（p29）株，由本實驗室提供，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。 實驗方法 1．實驗動物贈及給藥： C57BL／6純系小鼠，雌雄各半，隨機分成6組，每組10只，第二 組為正常對照組，第2組為低濃度p．lin砂Inl）給藥組，第3組為 ·2· 中濃度N．5 mg／Inl）給藥組，第 4組為高濃度門 mg／nil）給藥組，第 5組為環(huán)磷酸胺組，第 6組為環(huán)磷酸胺十地龍肽N．5 mg／Inl）組；2 3戶、6組分別以不同濃度的地龍肽灌胃，每日一次，每次0．ZInl， 連續(xù)7日，其中5在gg于給藥第三天肌注Cy100mg／k，一次，＼5 組每日以蒸餾水灌胃0．ZInl。各組均于第8天觀察各項指標。 2．NK細胞活性的測定：采用乳酸脫氫酶法。 3．巨噬細胞吞噬功能的測定：采用中性紅法。 4．NO測定：采用童氮化反應法。 5．TNF心測定：采用n29細胞作為敏感靶細胞 6．巨噬細胞毒效應測定規(guī)rIT比色分析法 7．統(tǒng)計學分析方法：采用t檢驗，方差分析 實驗結果 1．口服地龍肽對小鼠脾細胞中NK細胞殺傷率的影響 地龍肽在濃度為0．lin礦nl刀．sin牙IYl和linyInl時，均可顯 著提高＊K細胞的活性人P＜O．01L且濃度越大效果越明顯；環(huán) 磷酸胺作為免疫抑制劑可以從多方面抑制機體的免疫功能，其對 NK細胞亦有明顯的抑制作用；環(huán)磷酸胺組與正常組相比。自然殺 傷率降低，地龍肽可明顯桔抗環(huán)磷酸胺的抑制作用汗＜o．05八 2．口服地龍肽對小鼠腹腔＊ 吞噬功能的影響 與正常組相比較，地龍肽在各濃度N．ling／nd刀．5 mg／lld、 ling／ml）均能提高巨噬細胞的吞噬功能，但經(jīng)統(tǒng)計學處理后只有 低濃度組效果顯著u＜0．01L環(huán)磷酸胺十地龍肽組巨噬細胞吞 噬功能與環(huán)磷酸胺組相比較作用明顯增強（P＜O．05X說明地龍 肽可明顯桔抗環(huán)磷酸胺的抑制作用。 3．地龍肽體外對小鼠腹腔腫和脾細胞分泌NO的影響 0．L…giL LP可明顯提高巨噬細胞和牌細胞自發(fā)及經(jīng) LPS ·3· 誘生分泌＊o水平u＜o．01人且劑量越大，其作用逐漸減弱；地 塞米松作用于巨噬細胞和脾細胞后對．l上上＊
【關鍵詞】：地龍肽免疫功能NKM(?)NOTNF-α小鼠
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R285.5
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2003.091921
