首頁(yè) > 產(chǎn)品學(xué)術(shù) > 學(xué)術(shù)論文    水蛭地龍?zhí)崛∫捍倮w溶腦保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究

【中文摘要】目的:通過(guò)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain microvascular endothelial cells BMEC)細(xì)胞培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從體外直接觀察水蛭地龍?zhí)崛∫耗芊窦せ顑?nèi)源性纖溶系統(tǒng),即能否促進(jìn)培養(yǎng)的 BMEC 分泌組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator t-PA),同時(shí)增加其活性,及對(duì)纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor PAI-1)分泌及其活性的影響。從而揭示該制劑對(duì)缺血性腦血管疾病的作用機(jī)制。 方法:采用體外培養(yǎng)鼠大腦皮質(zhì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并用水蛭地龍?zhí)崛∫焊深A(yù)。培養(yǎng)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,各組均為 9 孔細(xì)胞,按 3×104個(gè)細(xì)胞/孔接種,培養(yǎng)至第 9 天細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底。實(shí)驗(yàn)組中加入不同濃度的水蛭地龍?zhí)崛∫?10mg/ml、20mg/ml、80mg/ml 稀釋濃度;另以 20mg/ml 濃度水蛭地龍?zhí)崛∫悍謩e處理 BMEC 8h、24h、48h。實(shí)驗(yàn)選取多項(xiàng)指標(biāo)觀察水蛭地龍?zhí)崛∫?對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組 BMEC 分泌 t-PA 和 PAI-1 的影響:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況、測(cè)定 t-PA 和 PAI-1 的活性和含量、以 RT-PCR 檢測(cè)兩者的 mRNA 的表達(dá)情況。 結(jié)果:⑴ 水蛭地龍?zhí)崛∫嚎纱龠M(jìn) BMEC 生長(zhǎng),藥物處理組接種時(shí)貼壁早,且分裂增殖快,聚集成簇,細(xì)胞胞體更大,細(xì)胞大多呈多邊形。⑵ 不同濃度水蛭地龍?zhí)崛∫航M，與正常對(duì)照組間比較，均能使 BMEC分泌的 t-PA 活性明顯增加(P<0.01)，隨著處理藥物濃度增加，t-PA活性也相應(yīng)增加，但各藥物處理組對(duì) PAI-1 活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。⑶ 水蛭地龍?zhí)崛∫海?0mg/ml）處理 BMEC 8h、24h、48h，各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)藥物處理組與對(duì)照組比較，均能增加 BMEC 分泌的 t-PA 活性(P<0.01)。且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，t-PA 活性增加愈明顯，當(dāng)藥物處理達(dá) 48h t-PA 活性達(dá)高峰，而對(duì) PAI-1 活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。⑷通過(guò)對(duì) BMEC 培養(yǎng)上清液中 t-PA 抗原含量定量分析，表明水蛭地龍?zhí)崛∫嚎擅黠@增加 BMEC 分泌 t-PA 含量(P<0.05)。⑸ 用 RT-PCR 技術(shù)對(duì)t-PA 和 PAI-1 mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)水蛭地龍?zhí)崛∫簩?duì)培養(yǎng) BMEC，在轉(zhuǎn)錄水平使 t-PA 的 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，但對(duì) PAI-1 mRNA 的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。⑹ 免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)隨水蛭地龍?zhí)崛∫簼舛鹊脑黾?，t-PA表達(dá)表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論：通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，可以得出以下結(jié)論：①水蛭地龍?zhí)崛∫捍龠M(jìn) BMEC 生長(zhǎng)，藥物處理組接種時(shí)貼壁早，且分裂增殖快，聚集成簇，細(xì)胞胞體更大，細(xì)胞大多呈多邊形。②水蛭地龍?zhí)崛∫涸黾?BMEC 分泌的 t-PA 活性，但對(duì) PAI-1 活性無(wú)明顯影響。③ 通過(guò)對(duì) BMEC 培養(yǎng)上清液中 t-PA 抗原含量測(cè)定，表明水蛭地龍?zhí)崛∫嚎擅黠@增加 BMEC 分泌t-PA 含量。④ 用 RT-PCR 技術(shù)對(duì) t-PA 和 PAI-1 mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)水蛭地龍?zhí)崛∫簩?duì)培養(yǎng) BMEC，在轉(zhuǎn)錄水平使 t-PA 的 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，但對(duì) PAI-1 mRNA 轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響。總之，體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)水蛭地龍?zhí)崛∫嚎纱龠M(jìn) BMEC 分泌 t-PA、增加其活性、增強(qiáng) mRNA 轉(zhuǎn)錄，表明水蛭地龍?zhí)崛∫嚎纱龠M(jìn)纖溶系統(tǒng)功能活躍，而不影響抗纖溶系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)。重慶醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文 5第 二 部 分水蛭地龍?zhí)崛∫簩?duì)缺氧引起大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞毒性損害保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究摘 要目的:本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平,觀察水蛭地龍?zhí)崛∫阂种迫毖跽T導(dǎo)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞壞死和調(diào)亡的作用,為臨床治療缺血性腦血管疾病提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:本實(shí)驗(yàn)制備體外培養(yǎng)鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧模型,選擇多項(xiàng)觀察指標(biāo)包括倒置顯微鏡下觀察正常和缺氧神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況、反映細(xì)胞損害經(jīng)典指標(biāo)乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的測(cè)定及用 Annexin Ⅴ-PI 雙染色法流式細(xì)胞儀進(jìn)行壞死、凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)等。結(jié)果: ⑴ 初種神經(jīng)細(xì)胞 2h 開(kāi)始貼壁,48h 后可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞形態(tài)比較單一呈圓球形,偶見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)出突起。第 5 天神經(jīng)元中混雜較多膠質(zhì)細(xì)胞,換 N2 培養(yǎng)液抑制雜細(xì)胞生長(zhǎng),至第 11 天,神經(jīng)細(xì)胞則生長(zhǎng)旺盛,胞體變大,長(zhǎng)出 2-3 個(gè)突起,突起變長(zhǎng),與鄰近的神經(jīng)元的胞體或突起形成突觸,大部分膠質(zhì)細(xì)胞死亡浮起,神經(jīng)細(xì)胞純化達(dá) 95%以上。⑵ 缺氧模型的建立:用于實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞置于 95%N2 和 5% CO2混合氣體培養(yǎng)盒中繼續(xù)培養(yǎng),血?dú)夥治霰砻?常氧、缺氧12h 和缺氧 24h 培養(yǎng)上清液中的氧分壓分別為的 16.7kPa(125mmHg)、2.8 kPa(21mmHg)和 2.4 kPa(18mmHg),結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)情況,缺氧 12h適合用作缺氧模型。⑶ 缺氧處理后細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率測(cè)定顯示,缺氧組乳酸脫氫酶釋放率明顯高于正常對(duì)照組(P <0.01)。水蛭地龍
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